Angptl2与2型糖尿病动脉粥样硬化的关系及对HUVEC功能影响的研究

【摘要】第一部分血浆Angptl2水平与2型糖尿病及CA-IMT关系的研究目的：检测2型糖尿病患者血浆中Angptl2水平及颈动脉IMT的变化,探讨其与2型糖尿病及动脉粥样硬化的关系,分析Angptl2与代谢相关指标的相关性,为阐明Angptl2对2型糖尿病动脉粥样硬化的影响提供依据。方法：选择50例健康对照人群(NC组)和99例2型糖尿组(DM组),检测体重、血压、空腹血糖、空腹胰岛素、甘油三酯、总胆固醇、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白,同时用高分辨率彩超检测双侧颈总动脉内-中膜厚度(IMT),双抗体夹心酶联免疫吸附法(ELISA)检测血浆Angptl2的水平,最后行数据整理及统计分析。结果：1.和正常对照组相比,2型糖尿病组血浆中Angptl2水平增高,并且和FPG线性相关；2.2型糖尿病组颈动脉IMT较正常对照组增厚,差异有统计学意义；3.在2型糖尿病组和正常对照组人群中,颈动脉IMT和Angptl2均有相关性；4.行多元逐步回归分析虽示,血浆中Angptl2和HDL水平变化均是颈动脉IMT增厚的危险因素。结论：1.和正常对照组相比,2型糖尿病组的Angptl2增高,并且和FPG线性相关,提示血糖可影响Angptl2的水平；2.2型糖尿病组颈动脉IMT增厚,提示糖尿病可以加速动脉粥样硬化的进展；3Angptl2和颈动脉IMT正相关,并且是其影响因素,Angptl2可能有潜在致动脉粥样硬化作用。第二部分Angptl2在高糖诱导的内皮细胞凋亡中的作用目的：观察高浓度葡萄糖对人脐静脉内皮细胞凋亡及Angptl2表达的影响,初步探讨Angptl2是否参与葡萄糖诱导的人脐静脉内皮细胞凋亡。方法：1.高糖对内皮细胞增殖的影响：HUVECs分别在在不同浓度梯度葡萄糖(5、10、20、30Mm),在5mM和30mM葡萄糖条件下培养不同时间(4、8、12、24、48h),以四甲基偶氮唑微量酶反应比色(MTT)检测细胞增殖；2.Angptl2水平的表达：HUVECs分别在不同浓度梯度葡萄糖(5、10、20、30Mm)以及25mM甘露醇条件下培养48小时,以及在5mM、30mM葡萄糖以及25mM甘露醇条件下培养不同时间(4、8、12、24、48h),Westernblot检测Angptl2的表达变化；3.血管生成素样蛋白2载体的构建；4.内皮细胞凋亡的检测：HUVEC分别在空载体组、30mM葡萄糖组、30mM葡萄糖+目的基因Angptl2组、目的基因Angptl2组、30mmM葡萄糖+LY294002组、目的基因Angptl2+LY294002(PI3K抑制剂)组培养48小时,以TUNEL法和Annexin-FITC/PI双染流式细胞术检测细胞凋亡。结果：1.MTT实验结果显示细胞增殖与葡萄糖呈量效关系,HUVEC细胞在5mM浓度葡萄糖作用下细胞细胞增殖与30mM浓度葡萄糖作用下细胞细胞增殖有显著差异(P<0.05)；并且在30mM浓度葡萄糖的作用下,采用梯度时间干预HUVEC细胞,发现HUVEC细胞的增殖与葡萄糖作用呈时效关系,30mM干预4h组与30mM干预48h组相比较,增殖有显著差异(P<0.05)；2.免疫印迹实验结果显示Angptl2与葡萄糖作用呈现量效关系,即葡萄糖浓度越高,Angptl2表达越高,两者为正相关性,30mM葡萄糖作用组与5mM葡萄糖作用组相比较,Angptl2表达水平有显著差异(P<0.05)；且Angptl2和葡萄糖作用呈现时效关系,即30mM浓度葡萄糖作用HUVEC细胞时间越久,HUVEC细胞中Angptl2的表达水平越高,两者为正相关性,30mM葡萄糖作用4h组与30mM葡萄糖作用48h组相比较,Angptl2的表达水平有显著差异(P<0.05)；3.通过PCR,及酶切,连接实验后所得产物,分子量和序列都符合预期设计；4.TUNEL法检测凋亡结果显示高表达Angptl2基因可以促使HUVEC细胞发生凋亡,同时抑制PI3K可以促使HUVEC细胞发生凋亡,30mM葡萄糖组与高糖诱导过表达Angptl2组相比较,凋亡率有显著差异(P<0.05)；30mM葡萄糖组与高糖诱导抑制PI3K组相比较,凋亡率有显著差异(P<0.05)；流式细胞数检测结果与TUNEL法检测结果相类似。结论：1.高浓度葡萄糖可诱导内皮细胞凋亡增加及Angptl2表达增加。2.Angptl2表达增加与葡萄糖浓度正相关,与高糖作用时间正相关。3.过表达Angptl2后,内皮细胞凋亡率增加,并在高糖状态下促进内皮细胞的凋亡。4.PI3K抑制剂LY294002可促进内皮细胞凋亡,高浓度的葡萄糖或者Angptl2蛋白的过表达也表现出与LY294002相同的反应。第三部分Angptl2促进内皮细胞凋亡过程中PI3K/Akt通路的变化目的：观察高浓度葡萄糖及Angptl2转染对细胞内关键通路磷脂酰肌醇3激酶途径(Phosphatidylinosjtol3-kinase/Akt,P13K/Akt)中PI3K、AKT、p-PI3K、p-AKT表达水平的影响,了解Angptl2是否通过PI3K/Akt通路介导高浓度葡萄糖诱导内皮细胞凋亡。方法：1.HUVEC分别在空载体转染组,30mM葡萄糖组、转染Ad-Angptl2组、转染Ad-Angptl2+3OmM葡萄糖组、30mM葡萄糖+LY294002组、转染Ad-Angptl2+LY294002组,分别培养48小时,以Westernblot检测PI3K、AKT、p-PI3K、p-AKT的表达；2.HUVEC分别在空载体转染组,30mM葡萄糖组、转染Ad-Angptl2组、转染Ad-Angptl2+30mM葡萄糖组、30mM葡萄糖+LY294002组、转染Ad-Angptl2+LY294002组,分别培养48小时,以Westernblot检测,bax、bcl-2蛋白表达水平。结果：1.免疫印迹检测p-PI3K、p-AKT结果显示：高浓度葡萄糖和过表达Angptl2基因可下调p-PI3K、p-AKT蛋白的表达水平,转染Ad-Angptl2组与转染Ad-Angptl2+LY294002组相比较PI3K/AKT活化水平有显著差异(P<0.05)；转染Ad-Angptl2+30mM葡萄糖组与30mM葡萄糖组+LY294002相比较PI3K/AKT活化水平无明显差异(P>0.05);2.免疫印迹实验检测bax和bcl-2表达结果显示：高浓度葡萄糖和过表达Angptl2基因可上调bax蛋白表达、下调bcl-2蛋白表达水平,转染Ad-Angptl2组与转染Ad-Angptl2+3OmM葡萄糖组、转染Ad-Angptl2+LY294002组相比较bax和bcl-2蛋白表达水平有显著差异(P<0.05)；结论：1.高浓度葡萄糖和过表达Angptl2都可下调p-PI3k、p-Akt蛋白的表达,高糖及过表达Angptl2有可能阻止Akt的磷酸化,导致内皮细胞凋亡增加。2.PI3k-Akt途径特异性阻断剂LY294002可增强过表达Angptl2诱导的内皮细胞的凋亡。在高糖中过表达Angptl2起到的阻碍效果与加入LY294002是一致的。3.过表达Angptl2可使bax蛋白表达量增加,bax/bcl-2的比值增大,细胞往凋亡方向发展。
【作者】孟庆欣；
【导师】钟惠菊；
【作者基本信息】中南大学，临床医学，2014，博士
【关键词】2型糖尿病；血管生成素样蛋白2；颈动脉内膜中层厚度；HUVEC；MTT；免疫印迹；构建载体；TUNEL法；流式细胞术；细胞凋亡；bax；bcl-2；载体转染；凋亡；PI3K/AKT信号通路；

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